背景及概述[1]
(3R,4S)-3-羟基-4-基-2-氮杂环丁酮，简称(-)β-内酰胺，它是一种非常具有潜力的手性药物中间体，它有两种异构体即（3R,4S）构型和（3S,4R），其中（3R,4S）构型的异构体的衍生物紫杉醇侧链C-13是制备癌症临床化疗具应用前景的新药之一多西紫杉醇的重要手性前体。
制备[1]
一种大豆慢生根瘤菌全细胞拆分3-羟基-4-基-2-氮杂环丁酮。该方法包括如下步骤：
（1）菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）作为菌种，菌种保藏号为CGMCC No.1.2550；该菌种保藏于-80℃；
（2）发酵液制备：将所述的大豆慢生根瘤菌菌种以0.1%～0.5%的体积比接种到根瘤菌培养基中，20℃～30℃，220rpm振荡培养96～168h；
根瘤菌液体发酵培养基：酵母提取物1.0g，甘露醇10.0g，土壤提取液200ml，蒸馏水800ml，pH7.2；
其中土壤提取液：25g土壤，加去离子水100ml，105kPa蒸煮1小时，过滤后加水补足到蒸煮前体积；
具体制备方法为：将酵母提取物、甘露醇、土壤提取液溶于去离子水，以NaOH调PH 值至7.2，于121kPa灭菌20min，得到所述的根瘤菌发酵培养基；
（3）菌体收集：将培养得到的菌体发酵液与pH值为7.0的磷酸缓冲液按照一定比例充分混合，得到稀释发酵液；然后在8000～11000rpm转速下离心10～15min，收集菌体沉淀； 再次用pH值为7.0磷酸盐缓冲液进行洗涤处理，离心后回收得到湿菌体，收集湿菌体作为生物催化剂使用；
所述的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液由0.05mol/l的Na2HPO4溶液和0.05mol/l的 NaH2PO4溶液混合而成，其体积比为7:3。
（4）生物拆分反应：将所述的湿菌体与1～10g/L消旋体β-内酰胺溶液混合，得到菌体混合液，其中500ul反应体系中包含60mg湿菌体；将所述的菌体混合液进行振荡培养，得到反应液；所述的消旋体β-内酰胺溶液为消旋体β-内酰胺与通用缓冲液，经过一定时间的超声处理后制得；
所述的不同pH值的通用缓冲液为Tris50mM；Boric acid 50mM；柠檬酸33mM； Na3PO4 50mM。用HCl，NaOH调pH3～12。
所述的振荡培养的温度为25℃～50℃，pH值5.0～10.0条件下，转速为200～ 220rpm，时间为3h～24h；
（5）样品分离：将所述的振荡后的菌液进行离心处理，转速为8000～12000rpm，时间为5～10min，得到上清液，即为所述的（-）β-内酰胺样品。
（6）HPLC测定：取500μL所述的（-）β-内酰胺样品与200μL充分震荡萃取，使目标产物溶解于；再取10μL所述的溶有目标产物的进样，利用手性 HPLC测定（+）β-内酰胺及（-）β-内酰胺的含量，计算得出ee值和（-）β-内酰胺的产率。
（7）以上所述的消旋体β-内酰胺为3-羟基-4-基-2-氮杂环丁酮或3-乙酰氧基- 4-基-2-氮杂环丁酮。
（8）对应于步骤（7）中的全细胞拆分后所得(-)β-内酰胺分别为(3R,4S)-3-羟基- 4-基-2-氮杂环丁酮或（3R,4S）3-乙酰氧基-4-基-2-氮杂环丁酮。
（9）3-羟基-4-基-2-氮杂环丁酮HPLC检测条件：色谱柱型号为Daicel公司 Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；以大赛璐AS-H手性柱作为固定相，100%乙腈，流速0.6ml/ min，检测波长210nm。
（10）3-乙酰氧基-4-基-2-氮杂环丁酮HPLC检测条件：色谱柱型号为Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；以大赛璐AS-H手性柱作为固定相，100%乙腈，流速0.4ml/ min，检测波长210nm。
主要参考资料
[1] [中国发明,中国发明授权] CN201410081161.8 一种以大豆慢生根瘤菌全细胞拆分消旋体β-内酰胺的方法【授权】
